在“困难样本RNA提取的技能你get到了吗？”文章中，我们对RNA提取原则和原理做了简单的介绍，并对部分困难样本进行了简短的总结和结果展示。
时间已经过去了两个月，在此期间不断有新接触RNA提取的小伙伴反馈说，看不懂RNA的质检结果，不知如何对RNA质量进行评价，今天就带大家一起看懂质检图。一般来说，RNA质检图有两种，先是经琼脂糖凝胶电泳初步判断样本的完整性，再是Aglient 2100 Bioanalyzer结果图更为精确的判断。
在看图之前，我们首先要了解Total RNA中绝大多数是核糖体RNA（rRNA），占总RNA的80%以上，mRNA在总RNA样品中仅占1-3%，所以我们质检图中直观反映的是rRNA的检测结果，依据rRNA的质量和数量可以反映潜在的mRNA质量和数量。达成了这个共识，我们就可以上图说话了。
一、 琼脂糖凝胶电泳胶图主要需查看以下几方面：
1.看目的条带是否明亮清晰
2. 看泳道内是否有降解弥散区
3. 看胶孔处有无蛋白污染
4. 看有无DNA污染
5. 看有无外源物种核酸污染
二、 在看Aglient 2100 Bioanalyzer电泳图前，我们需要了解一下沉降系数（S），即：反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。
s=v/(2‧r)，通常1S=10-13秒
不同生物之间rRNA的沉降系数存在较大区别，主要体现在以下三种组合：18s和28s rRNA（动物）；18s和25s rRNA（植物、低叶绿体含量的组织部位）；16s和23s rRNA（细菌）。同时，2100仪器检测RNA时，有三种程序对应这三种rRNA的组合。然而2100仪器在检测RNA时，只会根据所选择的程序标注出相应rRNA组合，不会根据片段大小进行调整。所以在进行安捷伦2100检测时，需要选择正确的程序进行电泳，不然细菌也可能会被标注成18s和28s。
1、典型真核生物电泳图
峰①为marker，25nt。
峰②为5s rR//www.58yuanyou.comNA和5.8s rRNA，大小分别为120nt和160nt。
峰③为18s rRNA，1900nt。
峰④为28s rRNA，4700nt。
峰⑤可能是前体RNA，浓度较低，距离28s rRNA较近。
这是典型真核生物2100电泳图中常见的5个峰，但不是所有真核生物都是这几个峰，在最后的案例展示中会简短的再介绍一些特殊质检图。
2、典型植物叶片电泳图中“c峰，d峰，e峰”则是叶绿体rRNA造成的。
3、典型原核生物电泳图
了解这些典型峰图后，我们再简单介绍下RNA完整度判定的金标准之一---RIN值。RIN值即为RNA完整值（RNA integrity number），这一指标从整体电泳图出发，以消除RN原由网A质量控制中的个人解释。RIN数值范围为1-10，将生物总RNA质量分类，其中1代表降解最严重的情况，10代表最完整。通过这种方式，有助于解释电泳图，令样品之间的比较成为可能，并确保实验的重复性。我们以真核哺乳动物为例，安捷伦2100质检的样本RIN值=2~10结果展示如下。从中可以看出RIN值越大，基线越平整、主原由网峰越锐利。
三：特殊案例展示
1、昆虫、软体动物
虽然也是真核生物，但一般基线平整即可，由于28s rRNA存在“隐裂”现象，产生了2个小片段：28s和28s，二者与18s重叠在一起形成了单峰趋势。造成没有28s或28s峰低的现象。
2、细菌
由于微生物种类繁多，若做过物、化处理，23s/16s值会差异较大。
3、动物细胞系
样品出现下图，18s rRNA和28s rRNA下分别有杂峰，这种多条带现象，可能是微生物污染，也可能是线粒体RNA造成的，在一些褐色脂肪等富含线粒体的组织中也会出现这一现象。
4、宏转录组
存在多条带现象。由于是宏样品，物种组成不单一，样品原由网是否合格需根据不同样品特性综合判断。
综上所述，在进行RNA质量评判时，RIN值不能作为RNA完整性评判的唯一标准，还需结合基线是否平整，峰型是否锐利，有无拖带，以及物种和模拟电泳图进行综合评判。
RNA质量直接影响文库和测序质量，若完整度较差，则会存在文库产量低、建库失败；测序数据随whASrigbjd机性差，可能会有偏好性；有效数据留存率低、mapping率低、基因覆盖不均匀、rRNA残留率高等风险，而对于Small RNA测序，则存在无目的条带、目的条带弱或杂带多；有效数据留存率低，reads分布异常等风险。本着对客户项目负责的原则，派森诺有着严谨的RNA提取和结果判定规范，助力各位老师项目高质量完成~
