继上一篇文章留下的问题,我们来继续分享。在肿瘤标本和癌旁标本的pcr实验中,因为不同个www.58yuanyou.com体之间的A基因mRNA水平是不一样的,所以不同个体之间不能算是实验重复。那么应该如何进行统计作图呢?
现在有20对病人某肿瘤组织标本,每对组织有癌(T)和癌旁(N)两个组织,我们想看基因A的mRNA水平在癌和癌旁中是否有差异?
实验设计及结果//www.58yuanyou.com
对20对标本(40个组织)分别采用提取组织mRNA的方式,protocol可以在科研狗网站http://www.keyangou.com 中找到,然后逆TWfeqy转录成cDNA。
进行qPCR之后我们会得到如下结果(只展示了第一对和第二对标本组织,T1代表第一对的癌组织,N1代表第一对的癌旁组织):
然后做完20对组织的qPCR之后,整理数据得到如下结果:
按照上一次案例1里面的统计方法去画图,
如果我们按照上一次案例1里面的统计方法去做,先求出N(癌旁)2^-△Ct的平均值n1,然后用T(癌) 2^-△Ct分别除以n1,再用每个N(癌旁)2^-△Ct处理n1,就得到了最终可以统计的结果T(癌) 2^-△△Ct,和N(癌旁)2^-△△Ct,具体计原由网算过程就不罗列了,整理结果如下:
如果接着作图,会出现如下结果:
你是不是吓一跳,癌和癌旁是不是没差异了?
但是仔细一看,从数据角度看来所有的癌里面A的表达水平都比癌旁低啊,为什么做到这个图上面,看上去这么不可能呢。
那么问题究竟出在哪里呢?
首先上一节中我们是三次重复试验,对于同一种药物作用于同一种细胞相同的时间,理论上三次独立重复试验中药物引起p53 mRNA水平的变化是确定的,而在本案例中,不同病人之间的标本不能算作是实验重复,不同个体之间的A基因mRNA水平也是不一样的。因此,不能采用案例1中的计算方式。
下面首先介绍下我们常用的模式:
我们用每组的T(癌) 2^-△Ct除以N(癌旁)2^-△Ct,得到T(癌) 2^-△△Ct,这样一来,N(癌旁)2^-△△Ct都为1,然后整理结果得到如下:
然后作图得到如下:
这个是不是比第一次柱形图好看?
但是这种做法其实是有问题的,虽然看上去差异比较大(通过统计计算差异也比较大),但是N(癌旁)已经没有误差,这是不科学的。
所以在本文中,我们以T(癌) 2^-△C和N(癌旁)2^-△Ct做成散点图,如下所示(注意不是△△):
把Y轴调整下如下:
可以看出,在癌旁组散点图位置均上移。我们通过SPSSTWfeqy软件统计分析两组之间的差异:
采用配对T检验(T检验的前提是样本服从正态分布,可以提前检测下,一般测定某一个蛋白或者mRNA的水平,可以看作是正态分布)。
p=0.007, 具有显著性差异。
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